抗生素等小分子化合物常使用竞争性免疫分析检测。与竞争法相比，非竞争性免疫分析有特异、灵敏、检测范围宽等优点，然而检测抗生素的非竞争性免疫分析方法种类有限，报道较少。近年来多种抗生素，如四环素类、喹诺酮类、磺胺类等，被发现具有光敏性（photosensitive），部分光敏抗生素可在光照下产生活性氧（ROS），而2，7二氯二氢荧光素（DCFH，无荧光）对ROS非常敏感，可被ROS迅速氧化成2，7二氯荧光素（DCF）并产生强烈荧光。上述原理有望用于建立抗生素非竞争性免疫分析。
对此，本研究建立了一种用于检测光敏抗生素的新型非竞争性免疫分析方法，并以盐酸去甲金霉素（DMCO）与多黏菌素B（PMB）为模式分子进行验证；使用特异性抗体分别捕获DMCO和PMB，然后进行光照使被捕获的抗生素产生ROS，将DCFH氧化为DCF，产生荧光信号，根据荧光强度与抗生素浓度之间的关系对待测物进行定量。以下是具体的研究内容：
1. 原理与概念验证
原理见上文，示意图如Schem 1所示。
微孔板包被DMCO与PMB的抗体后加入靶标孵育，洗涤后加入DCFH进行光照，发现DCF的荧光强度随着DMCO与PMB的浓度增加而增强（图1），初步证实了该试验设计的可行性。
2. 条件优化
对靶标孵育时间、DCFH浓度、光照时间、光照强度、抗体浓度等反应条件进行优化，用信噪比（S/N）高的条件建立检测方法。DMCO的最优条件见图2：孵育时间为3 h，DCFH浓度为8 μM，光照时间为30 s，光照强度为150 mW/cm2；类似地，PMB的最优条件见图S2。
3. 方法性能评价
3.1 特异性
测定了该方法与诺氟沙星（Norf）、磺胺甲二唑（SMT）、万古霉素（Van）等光敏抗生素以及卡那霉素（Kana）、庆大霉素（Gent）等非光敏抗生素等交叉反应率。结果如图3所示：检测DMCO时，交叉反应率均低于10%（图3a），检测PMB时，交叉反应率均低于7.3%（图3b）。上述结果表明，该方法特异性良好。
3.2 检测范围与灵敏度
该方法检测DMCO与PMB时标准曲线如图4所示。检测DMCO时，LOD=2 ppb，线性范围为5-1000 ppb，RSD=2.3%（图4a）；检测PMB时，LOD=58 ppb，线性范围为70-2000 ppb，RSD=1.6%（图4b）。因此认为该方法检测光敏抗生素时具有相当宽的线性范围和较高的灵敏度，且可重复性良好。
图4：DMCO与PMB的标准曲线
3.3 添加回收
在饲料与牛奶样本中分别进行了DMCO与PMB的添加回收实验。检测DMCO时，该方法在饲料中和牛奶中的添加回收率分别为80.1-92.5%、70.2%-75.5%，RSD=3.93%-9.05%（表1）；检测PMB时，该方法在饲料中和牛奶中的添加回收率分别为78.9%–88.2 %、68.1%–72.2 %，RSD=2.96%–6.95 %（表2）。总之，该方法可用于实际样本检测。
表1：DMCO的真实样本检测
表2：PMB的真实样本检测
【小结】
本研究建立了一种用于检测光敏性抗生素的新型非竞争性免疫分析方法，并用PMB和DMCO进行了验证。该方法的优点在于：仅需要两步加样（加入待测物和DCFH）操作简单，线性范围相当宽且灵敏度较高，使用的DCFH染料廉价易得，此外还可通过更换其他荧光染料提高方法的灵敏度；其局限性在于，仅能检测特定的光敏性抗生素，难以推广到其他靶标，普适性较差。
【原文出处】
Jiang, Q., Jiao, D., Yan, X., Zhang, J. & Cheng, Y. Light-assisted noncompetitive fluorescence immunoassay for photosensitive antibiotic detection. ChemistrySelect9, e202303987 (2024).
DOI: 10.1002/slct.202303987