ELISA——酶联免疫吸附实验报告

ELISA是一种敏感的实验方法，临床上可用于检测抗原或抗体，与标准曲线联用可定量检测其含量，从而辅助疾病诊断。

抗原（或抗体）吸附在固相载体表面；

抗体（或抗原）与酶连接；

当抗原和抗体特异性结合时，免疫活性和酶活性仍然保留；

遇到相应底物时，底物在酶的催化下水解显色

辣根过氧化酶（HRP）为ELISA中常用的酶，它催化的典型反应表示如下：

DH2 + H2O2 →→→ D + 2H2O

过氧化氢（H2O2）为HRP（酶）的专一性受氢体，即氧化剂。

多种还原性物质可以作为底物（DH2），为供氢体，如邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）、5-氨基水杨酸（5-ASA）、2,2'-连氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）铵盐（ABTS）等。

02 实验材料

乙肝表面抗体（抗-HBs）ELISA检测试剂盒

乙肝表面抗原（HBsAg）包被孔

抗-HBs阳性对照

抗-HBs阴性对照

酶结合物（酶标记的HBsAg）1瓶

洗涤液1瓶

显色剂A、B各1瓶

终止液1瓶

03 实验方法

常用的方法有直接法（双抗原夹心法）、间接法、双抗体夹心法、竞争法等，本实验采用双抗原夹心法。

试剂盒HBs包被孔（含HBsAg包被）→加入阳性/阴性对照血清→加入酶标记的HBsAg→洗板→加显色剂

04 实验结果

抗-HBs阳性对照孔加终止液前呈蓝色，加终止液后呈黄色；

抗-HBs阴性对照孔呈无色。

05

讨论

5-1阳性血清含有足量抗-HBs抗体，加入包被孔中，抗-HBs抗体与HBsAg特异性结合，形成不能被洗涤掉的免疫复合物

5-2加入酶标记的HBsAg后，阳性孔中有抗-HBs抗体，虽然已形成免疫复合物，但仍有未被占据的（HBsAg）结合位点；因而抗-HBs抗体可以和酶标记的HBsAg特异性结合，形成牢固的免疫复合物，使酶不被洗涤掉

5-3阳性孔经洗涤后，仍存在HRP酶，加入底物TMB后，能催化反应快速进行，反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色

5-4阴性血清无抗-HBs抗体，无免疫复合物形成

5-5加入的酶标记的HBsAg不能形成牢固的免疫复合物，因而酶可以被完全洗涤掉

5-6阴性孔经洗涤后，无HRP酶，加入底物TMB后不能催化反应进行，因而呈现无色