1 背景介绍
酶联免疫吸附试验（ELISA）作为免疫分析领域的核心技术，凭借其高灵敏度和特异性，被广泛应用于科研和临床诊断。
根据不同的抗体-抗原结合策略和信号放大方式，ELISA衍生出多种方法，包括：直接法、间接法、夹心法和竞争法，它们适用于不同的检测需求。
下面我们将系统阐述四类常见ELISA的技术原理，帮助你快速区分这几种方法之间的不同。
ELISA实验的核心在于酶催化底物显色的反应。
当目标分子被捕获并与酶（如辣根过氧化物酶HRP）标记的抗体结合后，加入无色底物（如TMB），HRP催化TMB与H₂O₂发生氧化反应，生成蓝色的可溶性产物（TMB二聚体），此时溶液呈现明显蓝色。
随后加入酸性终止液，酸性条件下氧化态TMB结构改变，蓝色迅速转变为黄色，最终通过测量吸光度值实现目标分子定量——颜色越深表明初始目标浓度越高。
3 ELISA的四种主要类型
1、直接法ELISA（Direct ELISA）
直接法ELISA的核心理念在于“简单粗暴，一步到位”。
在实验过程中，将目标抗原固定于固相载体，直接加入酶标记的一抗，一抗特异性结合抗原后，催化底物显色，显色强度与抗原浓度成正比。
直接法ELISA的优点是操作简单、步骤少、实验时间短；仅需一级抗体，不需要二抗，避免了交叉反应的可能性。
它的缺点是一抗需要酶标记，成本较高；同时，因为无需二抗，所以信号放大有限，灵敏度不高，特异性有限。
2、间接法ELISA（Indirect ELISA）
间接法ELISA是在直接法的基础上，通过引入二抗实现信号放大，其核心步骤为：抗原包被 → 一抗结合 → 酶标二抗结合 → 显色检测。
间接法ELISA的优点是一抗无需标记，且一种二抗可适用于多种不同的一抗，降低了成本。
降低成本；同时，二抗可以放大信号，提高灵敏度，适用于检测血清中的抗体。它的缺点是交互反应发生的机率较高，特异性一般。
3、夹心法ELISA （Sandwich ELISA）
夹心法ELISA是一种非常有效且常用的免疫测定技术，以其高特异性和灵敏度著称，适用于复杂样品中目标分子的定量分析。
双抗夹心法就是我们所说的夹心法ELISA。“双抗”指的是在这个过程中使用了两种抗体：一种是捕获抗体，另一种是检测抗体。
这两种抗体分别结合目标抗原的不同表位，从而形成“抗体-抗原-抗体”的三明治结构。捕获抗体预先固定于固相载体，捕获溶液中的目标抗原后，检测抗体结合抗原的另一表位，最终信号强度与抗原浓度正相关。
夹心法ELISA有两种主要形式：直接法和间接法。在直接夹心法ELISA中，检测抗体直接用酶标记；而在间接夹心法ELISA中，则使用未标记的检测抗体，然后利用酶标记的二抗来放大信号。
夹心法ELISA的优点是特异性高、灵敏度高，适合复杂样品中抗原的检测。
但它同时也有缺点，那就是无论采用哪种形式，夹心法都要求目标抗原至少有两个可被抗体识别的不同表位，以保证捕获抗体和检测抗体都能与之结合。因此这种方法不适用于小分子抗原，因为它们可能没有足够的表位供两个抗体同时结合。
4、竞争法ELISA（Competition ELISA）
竞争法ELISA是专门针对在样本中浓度非常低的抗原或小分子抗原检测的一种方法。
其核心步骤为：首先将抗体固定在微孔板表面；封闭后加入待测抗原和已知量的酶标记抗原，两种抗原竞争结合抗体；然后洗去未结合的抗原，加入底物显色。
而在对照组中仅加入酶标抗原（不加入待测抗原），此时酶标抗原充分结合抗体，显色最深。
因此，竞争法的检测逻辑与其他方法相反：当样本中目标抗原浓度越高，游离抗原与酶标抗原竞争结合固相抗体的能力越强，导致固相上结合的酶标抗原减少，最终显色信号减弱。
依据这个原理，我们就可以通过显色梯度建立“浓度-吸光度”负相关曲线，从而量化待测样本中抗原浓度。
竞争法ELISA适用于适用于小分子或强缺乏多个表位的半抗原，抗干扰能力。它的缺点是信号强度与待测物浓度成反比（浓度越高，显色越弱），因此需精确控制酶标抗原量。
讲了这么多，下面我们做了一个表格，将这几种方法的特点进行了对比总结：
希望这篇文章能够帮助你理解清楚这些方法之间的差异，选择合适的ELISA方法。
参考文献：
【1】https://microbenotes.com/indirect-elisa-introduction-steps-advantages-and-protocol/