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荧光免疫层析分析案例(一)——T/C受温度影响发生变化,测值产生偏差

2025-07-04

问题:试剂受温度影响特别严重,随着孵育温度升高,T线和C线均在升高,但是升高比例却不一致,导致相同样本测试完回算浓度差别较大。


举例:
某项目,不同孵育温度,测试其高值质控冻干品:
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分析:
1.  本项目抗原涉及裂解液,难道是裂解温度越高,蛋白浸出率越高?
      如果是这个原因的话,那就有可能是之前的裂解方式并不充分,有可能是裂解时间不够,也有可能是裂解液过于温和,那就可以通过延长裂解时间或者增强裂解效果来验证。
      备注:免疫层析裂解液不可以过于剧烈,因为它毕竟是直接参与反应过程的缓冲液,这就需要在裂解效果和反应强度之间做取舍。

2.  抗原的构象受温度影响?
      有没有可能是温度越高,蛋白位点暴露越充分?
      如果是这个原因的话,那么是不是可以考虑在裂解液中增加一些组分,可以稳定蛋白原来的构象,使其受温度影响不是那么严重?比如改变缓冲液种类、添加多元醇、筛选表活、增加金属离子或盐离子等。

3.  反应过程受温度影响,温度越高,反应越活跃?
T线和C线反应模式不同。
T线:微球标记抗体←抗原←NC膜包被抗体
C线:微球标记抗体←NC膜包被抗体
      T线上是一个类似夹心法的反应,游离的抗原作为一个被夹心物质;C线上相当于微球和NC膜直接接触反应,难道是反应模式引发的反应比例的增速不同?如果是这样的话,那该如何调整呢......
      是不是需要找几个C线系统,在不同温度下测试反应增幅,来匹配这个项目的T线的增速呢?
      或者说也做成一个夹心的反应模式,比如微球里掺入羊抗鸡标记物,C线位置同样包被羊抗鸡,结合垫位置增加一个鸡IgY垫,来测试反应温度带来的影响。

注:以上分析纯属臆测,如有碰到者可自行尝试。


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